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第三章 (上):玻璃化冷冻试剂:神话和现实

先有鸡还是先有蛋?我回答不了这个古老的问题,但我能肯定的告诉你,第一个成功冷冻保存的物种是家禽,不是卵子,而是精子。在生殖生物学中是个非凡而又经典的故事,但却不是例外。

二战刚结束后不久,雄心勃勃的英国年轻科学家克里斯托弗·波尔奇(Christopher Polge)就开始在伦敦从事家禽精子的冷冻保存工作。根据之前的一些研究,他们在培养液中加入不同浓度的果糖,果糖的加入能提高形态学存活率,但看似有活力的精子却无法进入卵子,更不要提受精了。于是克里斯托弗去度假了。

当他度假回来,他又重新开始工作,拿着架子上之前的旧瓶子做了另一次尝试。令他惊讶不已的是,情况有了好转!他很激动,但也很好奇为什么?

区别在哪里?他询问周围的每个人,并对瓶子里新的果糖溶液含量进行比较,这一次的确是不同的,浓度、溶剂效应、一切都不一样。

最终真相大白,原来是在波尔奇教授度假时,他的一个同事在他的工作台上进行了一项完全不同的工作:对精子进行微观评估。这个旧瓶子原本是用来给载玻片准备固定剂的,里面装的不是果糖溶液,而是蛋清、甘油和一种酒精的混合物。

很快,人们发现甘油是一种极好的冷冻保护剂,已故的波尔奇教授用它来冷冻鸡精子,然后冷冻牛精子,并且这两个物种都产生了后代。这一发现催生了一个完整的产业——人工授精(AI),由此产生了数十亿头从冷冻精液中诞生的牛。在细胞和组织培养、细菌学、真菌学中,甘油仍然是最常用的冷冻保护剂。几十年后,它也成为家畜甚至人类胚胎传统慢速冷冻试剂的主要成分。

这一切的发生都是因为一个愚蠢的错误。

我不能告诉你我的故事,是某个意外事件(停电,机器故障,时间安排不妥当,在午夜懒惰地回到实验室,计算错误等等)导致了一个具体问题的突破。我也不能告诉你,这种事发生过很多次。我不能告诉你,因为你会说我是科学界的憨豆先生。

但是,对于波奇教授来说,结果才是最重要的部分,而不是故事本身。因此,请正视你的错误,检查受尽你折磨的卵母细胞或胚胎,看看之后会发生什么。也许会有更好的结果,也许会有一个突破,也许某个糟糕的实验将决定你的整个未来!

关于低温冷冻保存的试剂成分有几个基本组成部分,包括:

1. 基础液:由几种(5-7种)或多种(20-40种)成分构成的生理盐溶液,包含了能量来源,维生素等,通常用于组织培养和胚胎学中;

2. 缓冲成分:维持在空气中稳定的生理pH;

3. 大分子物质:有机或无机化合物,其组成有明确的、半确定的和未确定的成分;

4. 冷冻保护剂

不同基础液对玻璃化结果影响的比较研究很少,大多数科学家认为它们只是这个过程中的次要部分,就像电影中的配角,或者赛车的轮胎。然而在实际情况中,轮胎在某些情况下可能会起到关键的作用,基础液的作用也不应该被低估。

根据我们的经验,使用简单磷酸盐缓冲溶液(PBS)就可以成功地玻璃化冻存牛胚胎。然而大多数公司为他们的玻璃化产品提供了更复杂的基础液。这些试剂通常是培养液的类似物,只是碳酸氢盐缓冲成分被另一个不需二氧化碳的缓冲成分代替了(见后文)。

由于胚胎培养液在90年代末至21世纪初得到了极大的简化,所以这些基础液成分也不复杂,特别是如果我们将它们与80年代第一代胚胎培养基或现在普遍用于体细胞/组织培养的培养基进行比较。通常情况下,胚胎并不需要如此复杂的溶液;在胚胎植入之前,它们生活在输卵管中,此时并不是绝对地在人体内部,而是通向外部世界的一个开放通道,在围绕胚胎的分泌溶液中有更简单的成分。很明显,适合胚胎培养的也应有利于玻璃化。

又或者不是?我们的“逻辑”理论并不能总适用于生物学过程。

家畜胚胎学家在有着更多的实验自由。而且,研究人类细胞玻璃化的先驱们在关于基本问题的有很多有价值的信息,这些信息在今天看来已经被遗忘了。

关于基础液,我们从“保守派”经验开始,使用一种高度复杂的介质,称为199组织培养基(TCM 199)。然后,我们将其与组成更加简单的新一代基础液进行了比较,两者之间没有发现明显的区别。所以我们遵从了时间这个词,开始使用新的、更简单的基础液,我们按照使用指导将这些新的基础液在4⁰的条件下存储了一个月、两个月……然后存活率会开始下降,并在基础液过期日左右变得更糟。这是我们在使用TCM-199时从未遇到过的情况。

这一发现从未发表过,只是在学术会议的晚宴上讨论过。随着同样的结果出现在美国、澳大利亚、欧洲,我们慢慢用回了TCM-199…

相同的情况也发生在原来的Hepes缓冲液上。许多公司提供了替代方案,其中最受欢迎的是MOPS。然而, 除Hepes缓冲的TCM-199外,任何成分在储存数月后都可能产生一些的负面影响,这些影响也许只有在到期日前后,但这类产品的保质期都不会太长。相比之下,Hepes缓冲的TCM-199在时间上会提供慷慨的援助,从而能长期保持一致性,它是可靠的。

在我的故乡匈牙利有一句谚语:“所有吉卜赛人都称赞自己的马”。没错,VitaVitro韦拓生物的冷冻液产品中基础液为Hepes缓冲的TCM-199。

VitaVitro韦拓希望为基础液提供最好的成分,而且我们也确实选择了这个解决方案,因为我们和我们在世界各地的同事朋友们都认为它是最好的。

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