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第三章(下):玻璃化冷冻试剂:神话和现实

3. 大分子物质在低温保存时并不是必需的,但添加这些物质是非常可取的。它们的作用很难具体说明,一般来说,它们可以保护样本并提高存活率和随后的发育率。产生这种效果的一方面原因可能是渗透压的贡献,因为可以使用更低浓度的非渗透和渗透冷冻保护剂(见下文);另外一方面的原因可能是溶液黏度的增加会减少操作过程中的机械损伤。大分子物质可阻止卵母细胞和胚胎附着在塑料和玻璃皿表面,也可以通过简单的覆盖或特定的结合来保护细胞膜。

在胚胎学领域,有一项持续了50年的尝试,即在所有过程中使用有着明确定义化学成分的的培养液,以增加一致性和减少污染的危险。尽管人们进行了多次尝试, 可直到今天,这些努力大部分都还是失败了。 其中被认为最有前景的是聚乙二醇(PEG),聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚蔗糖。然而,独立的比较研究发现这些成分的效率都低于蛋白质。

近年来,羟丙基甲基纤维素(HPMC)被广泛应用于工业生产中。种材料是由纤维素经过相当剧烈的化学改性而制成的,它既可用于医疗目的(包括局部眼部治疗和药物表面涂层),也可作为无麸质面包的谷蛋白替代品。它不会被消化道吸收,因此被认为是无毒的。

然而,它可能在眼部治疗时会引起过敏反应,也可能会引起肠胃不适,但这正是谷蛋白敏感的人希望消除的。尽管有一些支持性的论文,但是根据以下的原因,我们在HPMC的使用上仍需要一定的谨慎。

a: 玻璃化溶液的浓度相对较高;

b: 对玻璃化的样本,尤其是复苏后的样本缺少保护机制;

c: 在体外没有任何屏障(如肠壁)来保护卵母细胞和胚胎。

在体外受精培养基中最常见的大分子是从人血清或血浆中提取的蛋白质。这一类的产品种类繁多,包括最常见的人血清白蛋白(HSA)、含球蛋白和脂蛋白的血清代物(SSS),以及来自世界各地不同生产商的类似添加剂。早些时候,人血清也在这个清单上,但因为毒性和潜在的污染问题,它就不再被使用了。在世界上许多国家,政府会通过法规来限制在生殖过程中使用这些添加剂。幸运的是,在人类细胞的玻璃化中,HSA的使用不受限制并且它是完全适合于玻璃化。

4. 抗冻蛋白很难分类。根据定义,它们既是大分子物质又是冷冻保护剂。它们是生活在恶劣环境中的生物体的产物,因为这些生物体需要在零度以下的环境中长时间生存。这些蛋白在一定程度上可以阻止冰晶的形成。在幸运的情况下,与冰点有几度温差也足以保证生存。

为了把我们从分类的任务中解放出来,我不得不告诉你,分类没什么必要,因为这些蛋白可能也是不需要的。在过去的30年里,这些抗冻蛋白的应用在发表了几篇论文后反复出现和消失。也许它们在某些脊椎动物的未来超低温保存中会有一些有限的作用,但在我们(对不起,是你)的生命和我们人类中是不太可能的。

5. 冷冻保护剂是玻璃化溶液中最重要且几乎不可或缺的成分。对于雄性配子来说,这种 “几乎” 是必需的,其结构极为紧凑、含水量低,为无冷冻保护剂的玻璃化提供了一定的机会。

然而,对于大而致密化的卵母细胞,以及从受精卵到孵化囊胚的所有阶段的胚胎来说,冷冻保护剂是绝对需要的。

这些化学物质可以是渗透性的,也可以是非渗透性的。

这不仅仅是一个(愚蠢的)“学术”诡辩,它还意味着一项不同的任务,尽管这项任务略有重叠。

非渗透性冷冻保护剂的作用是在降温前通过逐步增加缓慢的压榨作用,将水从胞质中挤出,并使细胞在复苏时不因渗透休克而涨破。他们实际上没有更多的功能,只是压缩和保持压缩,唯一的额外要求是无毒。从这个角度来看,蔗糖和我们日常生活中饮用的咖啡、茶和含糖可乐中最简单的糖没有差别。所以,仅仅是普通的蔗糖,没有别的了。

比较势利的版本是海藻糖,然而它也只是另一种糖而已,没有任何额外的好处,只是价格高得多。不管怎样,有些人更喜欢阿斯顿·马丁,而我开着一辆有20年历史的丰田巡洋舰。

让我们继续冷冻保护剂这个话题,另一组冷冻保护剂也与汽车相关。

有机溶剂是极好的冷冻保护剂,包括传奇的甘油。但是其他的,包括传统的乙醇,也被成功地用于这一目的。(一些实验室——包括世界著名的实验室,对使用乙醇喷雾净化表面非常偏执。他们可能不知道胚胎可以忍受浓度高达10%的酒精长达几分钟,这种环境甚至可以刺激它们的发展。没有人能在血液中酒精浓度达到这种浓度十分之一时存活)

但说到汽车,乙二醇(EG)是一种毒性较低、最有效、最可靠的玻璃化冷冻保护剂,也是汽车冷却液最重要的组成部分。原理是一样的,防止结冰。我们只是运气好,解决办法就在我们的车库里。

可惜单独使用乙二醇(EG)并不是最好的策略。所有可渗透的冷冻保护剂都有一定的毒性作用,但这种作用在不同的低温保护剂之间是不同的。如果我们使用两种冷冻保护剂,每一种的毒性均减半,冷冻保护效果保持不变甚至会提高。

无论如何,仍然有许多团体和生产商信任二甲基亚砜,并抵制一些生产商的广告宣传替代品(丙二醇)是“无毒的”——事实上,其毒性比二甲基亚砜高出一个数量级,更重要的是——效率更低。

是的,但是第二种可渗透的冷冻保护剂应该是什么呢?在这里,实验室和生产商之间的争论是激烈的,战斗到第一滴血,甚至更进一步。其中有几个候选,但两个最具竞争力的是丙二醇和二甲基亚砜(DMSO)。

事实上,DMSO只是运气不好。它是一种优秀的冷冻保护剂,也是一种优秀的溶剂,毒性比其它竞争对手都小。作为一种良好的溶剂,它被用于动物实验中溶解可疑的致癌物质。它的效果很好,但是由于效果太好了以至于降低了被测试的溶解物质的致癌作用。所以他们停止使用它。

现在许多科学家只听到了部分故事,并将DMSO与致癌联系起来。这听起来很像那个“卷入抢劫案”的人。是的,他参与了,他被抢劫了……

无论如何,仍然有许多团队和生产商相信DMSO, 并抵制一些生产商把丙二醇作为“无毒”的广告。事实上,丙二醇的毒性比DMSO大一个数量级,更重要的是,它的效率更低。

当我在丹麦做牛胚胎学家的时候,我有幸研究了成千上万的卵母细胞和胚胎。我利用这个机会测试了这些冷冻保护剂的许多可能的组合。最后发现了EG和DMSO在稀释的和浓缩的溶液中的最佳比例。

所以,我们有了这样的组合:

HEPES缓冲的TCM

人血清白蛋白

蔗糖

二甲基亚砜

乙二醇

当然,还有OPS敞开式玻化冻存管

拓展阅读:

VitaVitro韦拓生物生产的玻璃化冷冻、解冻试剂盒,自2018年获得FDA后,销往欧洲、美国及亚太等国家及地区,并获得市场高度认可,尤其是在卵子冷冻技术的应用上也得到了广泛好评。现阶段,VitaVitro韦拓生物与国内多家辅助生殖中心积极合作并开展临床试验,我们致力于为本土的医生学者提供高品质的产品和先进技术。

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