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关于玻璃化冷冻后的再水合时间讨论

       在玻璃化冷冻后,解冻操作方法建议在1M蔗糖中解冻,在0.5 M蔗糖中稀释,并在基础液中进行5 + 5分钟的洗涤/再水合,有的方法建议在最后两种无糖基础液中只需要5 + 1分钟的再水合时间。我个人认为第一种方法更可靠,下面请允许我分享下自己的理解和一些实践经验。
       二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇(EG)是胚胎学中使用的毒性最小的渗透性冷冻保护剂。不过,它们也不是完全无害的。胞质内冷冻保护剂的浓度尽管远远低于最初的玻璃化冷冻方法,但是所需的浓度依然很高,而且与普遍的看法即浓度不高于传统的慢速冷冻法相反。解冻后,存在于细胞质中(或囊胚的囊胚腔中)的高浓度冷冻保护剂需要足够时间脱离,而大多是被动的。
       同时,卵母细胞和胚胎的代谢状态严重受损,修复也需要时间。不是几分钟,很可能是几个小时。如果在此期间胞质中存在DMSO和EG,修复就会延迟,导致细胞死亡,或影响后续的发育。
       在做牛胚胎研究中,我发现牛胚胎克隆和激活后,需要彻底的洗涤。比如,牛的重构胚经DMAP激活后,在操作液中清洗3次,5分钟后再进行体外培养。这一步骤通常发生在深夜,一天的辛苦工作之后,胚胎学家想回家睡觉。因此,对于一些胚胎来说,最后5分钟的清洗时间有时会缩短甚至省略。幸运的是,我们培养的胚胎要么是单独培养,要么是少量共培养,第一批和最后一批之间的差异是相当令人震惊的。几次失败后,我们不得不意识到——无论是否累了、饿了、困了,我们必须进行彻底清洗,否则,一整天的工作就白费了。
       如果这种情况发生在DMAP激活液上,或许也有理由相信有可能发生在DMSO和EG上。我开始关注玻璃化冷冻复苏后的情况,发现了一些意想不到的问题。
       研究显示,彻底清洗是十分必要的。缺乏这一点可能不会立即导致戏剧性的改变,但结果的一致性将会降低。如果省略最后5分钟,玻璃化后的胚胎会更敏感。如果用微滴单独培养;或大液滴共培养,胚胎彼此接近,生存就会受到损害。此外,不同发育阶段之间存在的敏感性差异也可能产生影响。卵母细胞表面再水合对卵母细胞的伤害可能比晚期胚胎更大。尽管如此,囊胚和扩张囊胚也可能因不精细的操作而受影响。
       有些观点可能认为胚胎直接移植,即胚胎在解冻后几分钟,用蔗糖溶液将胚胎直接移植到子宫(指的是牛的胚胎移植)。这是一个完全不同的问题,在那种情况下,我们是幸运的。与培养皿不同的是,子宫提供了一个良好的环境,可以安全有效地补充水分,并适当地更换溶液。同时,这个过程似乎是一致的和缓慢的——不用着急,无需秒表,没有流程。对于人类,对于病人,对于手术室,这种精确的时间安排是非常困难和危险的。
       在实验室里,有成百上千的(保守估计的)因素可能导致不一致的结果。我们必须尽力降低风险。为了培养这些胚胎,需要许多人(准父母和他们的家人、医生、胚胎学家、护士、行政人员等)的共同努力。为了消除哪怕是极小会失败的可能性,我们这4分钟的等待可能都是值得的。结果可能不会有惊人的不同,但从长期来看,可能会在一致性方面有一些改善。

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