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第一部分:胚胎培养的问题

提示:18岁以下严禁观看

简介

       根据一般性假设,实验室胚胎学是最先进的科学分支之一,可以与太空研究、分子遗传学、计算机和核科学技术相媲美。作为胚胎学家,我们不会刻意地去反对这种观点。然而,在一次会议晚宴结束后的非正式讨论中,我尊敬的美国朋友Rodney Wade发表了在场大多数人都同意的“不朽”言论:”高科技?算了吧。试管婴儿是低科技…”。虽然他是在20年前说的,但这番话在今天比以往更加贴切。

       不要感到被冒犯,这不是针对个人。很遗憾,但这只是事实而已。

       哺乳动物的胚胎学的开始似乎不太完美;相比之下,包括无脊椎动物或爬行动物的发育生物学在内的其姐妹分支学科反而更成功:在第一次世界大战(没错,即使是在19世纪)之前就已经通过细胞核移植克隆出了后代;但这些成果在此后的一百年内都未能在哺乳动物身上重现!

1952 – First successful nuclear transfer

       更让人吃惊的是,在上个世纪50年代,我们已经有了核弹、人造卫星、电视机、第一台数字计算机,但却没有诞生在体外培养的哺乳动物胚胎,这是为什么呢?

       如果你问一个现在的小学生:保护哺乳动物胚胎在体外受到损伤最重要的事情是什么?我相信他会说:让它保持温暖。毕竟我们谈论的不是爬行动物或两栖动物,而是恒温动物,不是吗? 毫无疑问,一百年前的小学生也会给到同样的答案,只不过没有被问及罢了。

       回想起来,这似乎很荒谬,这些受人尊敬的胚胎学者无视了一个明显的事实,即哺乳动物的卵细胞和胚胎对温度变化极其敏感。这与青蛙和蝾螈的不同,因此不能将其暴露在室温下,哪怕是很短的时间。各种哺乳动物之间的核心温度差异看似微小,但却对卵细胞和胚胎体外培养有着很大影响。适合人类胚胎的最佳温度对牛和猪的胚胎来说却是毁灭性的,反之亦然,尽管它们之间的差异只有几乎可以忽略不计的1.5-2.0℃。

       正如你所知,迄今为止培养和培养箱依然是影响胚胎学的关键因素。在这篇博客中,我将总结在推进实验室胚胎学发展过程中起到决定性作用的故事。这些决定性的故事同时也是有争议性的,既有积极的一面,也有消极的一面。      

细胞/组织培养箱的发明

       尽管在几千年前,中国和埃及就已经将火焰加热的孵化器(或者说是孵化室)用于鸡蛋,但在中世纪,这种系统基本上被遗忘了。最初的时候是在干燥的炉子里通过采用精确的温度计(Réaumur,1730)和相对合适的加热方式。然后是在19世纪末使用煤油灯,在关闭培养箱门之前点燃一支蜡烛以提高箱内二氧化碳水平,这时的培养箱开始变得适合在实验室使用。

       令人费解的是,第一个电加热的培养箱不是用于组织培养,而是用于运送早产儿(Hess,1922)。随后电加热培养箱逐渐成为所有实验室的标配。在50-60年前,气体混合物或混合器也最终被用于维持培养所需的二氧化碳水平,而那正是哺乳动物胚胎学诞生的时候。

The Hess transport incubator (1922)

       (你现在可能会说。“那么,你怎么能责怪胚胎学家的迟到呢?那个时候,他们缺少对他们的工作不可或缺的基本工具!”

       好吧,如果他们知道需要什么,他们可以自己制造。在100年前,甚至是200年前就可以通过使用少一点科技,多一点创造力和手工的技术来建造一个高度精确、相对完美的孵化器。

       试想一下,制造一个可以承载小密封盒的的水浴槽,然后将热水和冷水(常温),分别装入不同的桶中。通过向桶中分别加入热水和冷水,使水浴槽中的水始终保持在37℃。将样品放进密封盒之后关上盒子,然后用嘴对着一个小孔吹气。气体中所含的二氧化碳几乎与所需的浓度一样多,足够低的氧气浓度和接近100%的湿度,而且气体已经被预热,甚至已经被你的肺预先过滤。随后将小孔密封,并把盒子浸入水浴槽中。接下来只需要反复添加热水或冷水来维持温度,也许需要你与其他人轮流工作5-7天。

       信不信由你,与这个系统有着密切的相似之处,你可以在牛和猪身上获得高达50%的囊胚率。我做到了,而且可以随时随地证明这一点。)

       总之,通过电加热,以及相对精确的温度控制,和标准的5%二氧化碳补充,我们有了在实验室条件下培养哺乳动物卵母细胞和胚胎的便捷条件。最初所有的人类、家畜和实验室胚胎学的成功都是在这些大型的箱式培养箱中取得的。

       然而很快,在90年代初,我们意识到哺乳动物的卵母细胞和胚胎可能需要一个不同的体外环境。

尝试建立合适的胚胎体外培养系统

Quod licet bovi – licet Iovi?

(联系我们,获得帮助)

       最初,由于病人数量和周期数少,再加上移植前的培养时间短等原因,传统培养箱的缺点和局限等问题并不明显。不寻常的是,这些问题最先不是由人类胚胎学家意识到的,而是牛的胚胎学家。原因有三:

       1. 通过阴道超声引导在从未受促排卵的动物身上取卵,可以从雌性动物身上获得的大量高质量的未成熟卵细胞,有望在牛育种方面取得另一个可与人工授精相媲美的突破;

       2. 同时,从屠宰场收集的卵巢和数十亿的冷冻精液,为实验室提供了没有任何生物伦理问题的无限试验样本。因此,牛胚胎学家们找到了牛卵细胞体外成熟的有效方法,成功率高达90-95%,精子获能和体外授精也非常成功,卵裂率可达80%—90%,并发育到了8-细胞阶段,具有与体内成熟相媲美的生物学价值。

       3. 然而,曾经传奇的 “8细胞阻滞”需要再过十年才能被攻克。遗憾的是,与人类相反,牛胚胎只能在非手术胚胎移植的条件下才能发育到囊胚阶段。即使有为数不多的胚胎逃过了阻滞,并发育成”囊胚”,也会明显受损:细胞数更少,内细胞团更小,细胞质颜色深且充满脂滴。令人沮丧的胚胎移植结果,让动物育种公司望而却步,重新考虑了他们对相关研究的财务支持。

       此外,在90年代流行的牛海绵状脑病(俗称:疯牛病)造成了大量牛的死亡,自杀的养殖人员甚至比受到这种病毒感染的人数还要多,剩下的养殖人员也丧失了信心,不愿意引进任何新技术,直到今天,这件事造成的影响仍然存在。

       虽然研究牛的胚胎学家人数骤减,但他们最终还是发现了胚胎体外发育不良的原因;而他们建立的原则也在几十年后被人类试管婴儿技术所接受和应用。

这些原则包括:

–     不要使用复杂的组织培养基,如TCM-199,而是将体内的情况作为主要参考,再通过各种方法将培养基成分限制在胚胎发育所必需的成分上,最终的成分需要与体内的成分相似。

–       在雌性配子和胚胎在实验室的整个期间,建立一个高度稳定的环境,包括所有基本参数,尤其是温度。

–        作为上述尝试的一部分,根据体内情况,将大气中标准的”5%二氧化碳”修改为含氧量较少的混合气体。

       第二条和第三条原则在所有家畜中都被认为是有效的。然而,这究竟是纯粹的运气?还是来自大自然的慷慨支持?相较于那些成功培育出了其他哺乳动物(包括猪)的培养液,为牛胚胎而开发的胚胎培养液却更适合人类。

 

       同时,那些虽然丧失信心但却依旧求知若渴的牛胚胎学家们依然在人类领域继续他们的事业。尽管很少有人能够完全接受相关学科,但这些新鲜血液和全新理念为人类体外受精找到了合适的替代品。

 

        首先,在低温保存(玻璃化)和胚胎培养方面。

 

        哺乳动物胚胎培养箱的开发

        任务看起来似乎很简单。……(未完待续)

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