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第二章:载杆对降温-复温速率的影响

如上期博客中提到,早期玻璃化冷冻实验是在传统低温贮存容器中进行的,如0.25ml塑料精液麦管或冻存管。这些工具并非为这个目的而设计,它们的管壁较厚,所需液量较大(麦管需5-7μl;冻存管需10μl以上)。因此,理论上可实现的降温和复温速率非常有限(麦管大约在2000℃/min;冻存管的速率更低,所幸很快就被淘汰)。为了避免麦管的崩裂或爆炸,我们在降温和复温时采用两步法,然而这些操作势必会增加操作的不一致性。此外,这些大体积液体在极端压力变化下的不均匀凝固导致了玻璃化的冷冻液开裂和内部细胞的破裂。所以,传统冷冻的低效性并没有被消除,反而是大部分的问题没解决的情况下又增加了更多的障碍。毫无疑问,我们需要新的载体。

多亏哺乳动物胚胎学家惊人的“创造力”,十多年来没有发生任何进展,几乎所有的“专家”都接受了这些限制和缺陷。好吧,我不得不承认——在这漫长的七年里,我在这种无能为力中也扮演了重要的角色。

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当然在这期间也有过一些初步的尝试,例如在无任何载体的情况下直接将胚胎滴入液氮中(Lauda and Tepla, 1990)。很棒的主意,可惜它不起作用,第一次的尝试就可以证明这一点。为了形成液滴,最少需要5μl高浓度的冷冻液,这与取得适当的降温速率还差很远。另外,一旦液滴到达液氮表面时会开始漂浮并且会在水面上维持长达数秒的无规则的游动。原因很简单:液氮在零下196℃达到沸点。任何温度较高的东西,如我们的液滴和样品都会引起液氮的大量蒸发,产生的蒸汽层就像一个很好的隔热层,能够阻止液滴下沉,这样的操作的结果甚至于测量不到的冷却速率,可以说是惨不忍睹的。基于这个三重缺陷的方法的论文被重复发表了10年之久。

另一种途径是液滴最小化法(Arav, 1992),这是一种明显改进并值得注意的方法。但是这个方法需要昂贵的低温显微镜,无法用于日常实践。

最终电镜铜网作为载体开始被应用,这是一个有着巨大潜力的方法,是第一个充分利用小液体量并使用了直接接触的方式(Martino et al, 1996);事实上这也是迄今为止最好的解决方案之一。尽管对液体体积的标准化和一致性依然是个问题,但少量的液体。导热金属增加了冷却和复温速率,快速固化的液膜使样品安全地放在表面上,加热后取出也很容易和安全。这种小金属网改变了游戏规则,为降低低温保护剂浓度和开发小体积直接接触方法的实用价值开辟了道路。

然而,由于载体微小,缺乏正确识别和实际存储的解决方案,限制了其在实验实验室的应用。

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我们必须明白:胚胎学家更喜欢使用麦管工作。胚胎实验室里的所有东西,或者几乎任何样本如:早期胚胎、囊胚、精子、卵母细胞(其中只有一小部分在以往的存贮方法中存活)都是低温存贮在麦管里的。所有的杜瓦罐和其它液氮容器也都是为麦管存贮而设计的。他们不想为了进入一个新领域的挑战而放弃整个基础设施。

因此,如果他们想要麦管,我们就提供经适当的改进后的麦管给他们。这就是第一个专门为达到少液体量和高降温/复温速率目的而设计的玻璃化载体——敞开式拉管OPS( Vajta et al., 1998)。

好处是显而易见的。易于操作,它就像是一支笔。通过液滴和毛细作用,使用极少量的液体轻松加载。由于样品一直悬浮在液柱中,因此不会附着在表面上,也不会变形。液柱和管状结构也防止了加载后渗透压变化带的风险。在有着相对坚固和安全的构造的前提下,OPS的降温和升温的速度还是达到了要求。在降低了保护剂的浓度的同时取得了包括人类在内的许多哺乳动物的胚胎和卵母细胞的高存活率,容易存储在液氮罐中,利用管内受热膨胀的空气自动排出样本,在解冻皿中轻松地复苏样本。

根据我个人的看法,对一个初学的胚胎学家而言,学习和持续使用OPS在学习和使用在比过去22年中其它任何设计或商业化的高速率玻璃化冷冻载体都要简单。更重要的是,在OPS之后引入的方法都不能提供更好的存活率、更一致的结果或更广泛的适用性。The original is the best.

这或许只是纯粹的运气,但事实的确如此。

当然还有其它选择,比想象的还要多。据估计,目前至少有100种高速率玻璃化方法。有好几年,几乎所有与玻璃化冷冻打交道的人都通过细微的改变建立自己的玻璃化装置和方法,更不用说个人因素。创造只是问题的一部分,第二项任务也许更具挑战性,就是命名。“Cryo”和“Vitri”绝对是用得最多的,后面接上不同的后缀,如“leaf、top、lock、tip、safe、inga”等,其中也包括用玻璃微管(请注意有些国家使用玻璃进行低温存贮是不合法的)改造的OPS、胶质上样吸头、密封式拉抻麦管(CPS)、无菌剥卵管、移液吸头;这仅仅是一小部分例子。

哪一个是赢家?

如果我们从数量上看,赢家是那些有强大商业背景支持的。如果我们从科学认知角度上看,情况就不一样了。关于OPS的原始描述的文献(Vajta et al., 1998)仍然是玻璃化领域中被引用得最多的。这个方法广泛应用于和玻璃化相关实验和家畜胚胎学中, 世界上几乎所有的冷冻保存后胚胎诞生的克隆动物都是使用OPS方法。如之前所述,一种后来改变了整个人类辅助生殖尝试:首例通过玻璃化存贮的人类卵母细胞诞生的婴儿是通过使用了OPS方法,OPS仍然是人类胚胎干细胞玻璃化最有效的方法。

    虽然 OPS的商业化被推迟了,但如今韦拓生物生产的敞开式玻化冻存管(OPS)相继获得美国FDA认证和中国医疗器械注册证并陆续开展全球销售。我完全相信,在未来几年内,OPS将成为中国乃至世界范围内最受欢迎的人类胚胎和卵母细胞冷冻保存技术之一。

A screenshot of a cell phone

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当然,这只是开始。

参考阅读:

1. Vajta G. Vitrification in ART: past, present, and future. Theriogenology 2020 (in press).

2. Vajta G. Vitrification in human and domestic animal embryology: work in progress. Reproduction, Fertility and Development 2013; 25:719-727.

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